类胡萝卜素裂解加氧酶（CSO2）突变体的理性设计及其提高香兰素产量的机制研究

香兰素是一种食品香料物质，是香料工业中最大的品种，具有重要的经济效益。香兰素的传统生产方式有植物提取法和化学合成法，但是分别存在产量低和能耗高、污染大等缺点，而采用酶/微生物催化工艺转化天然前体阿魏酸制备天然香兰素，符合欧盟和美国对于天然香精的食用安全要求，具有重要的产业应用前景。

本团队重塑并优化了由阿魏酸脱羧酶FDC和单加氧酶CSO2组成的非辅酶依赖的香兰素酶法合成体系，以阿魏酸为底物，香兰素产率达到40.2%，高于前人报道的固定化方法(35%)。为了进一步提高香兰素的产率，团队对限速酶CSO2进行理性改造，得到了突变体A49P，Q92E，L140P，P165T，Q390A和I234A。与野生型相比，突变体A49P和Q390A的催化效率提高至1.6倍和1.64倍。将CSO2及其突变体应用于香兰素酶法合成，在A49P和Q390A的合成体系中香兰素产率分别提高至58.44%和65.29%。团队进一步对机制进行了探究，发现A49P无论从热变性温度还是热稳定性（15-35℃）均高于野生型，因此A49P可能是通过提高蛋白的催化效率和热稳定性，促进了香兰素产量的提高。

本研究优化了非辅酶依赖的香兰素酶法合成体系，通过定点突变策略成功提高了限速酶CSO2的活力，所得CSO2突变体A49P和Q390A可以将酶法合成香兰素的产率分别提高至1.45倍和1.62倍，可有效降低产业成本，具有重要的应用价值。

突变体提高香兰素产量的机制分析